扩增子测序能满足的测序长度是多少？

Miseq PE300平台测序长度为600bp，但其测序质量较差，质控需要过滤掉超过100bp质量较差的序列；Hiseq2500 PE250平台测序质量较好，但测序总长度为500bp，去掉12bp的barcode和部分质量较差的序列之后只剩460bp左右。所以保守起见，扩增子片段长度不能超过460bp，否则双端测序结果将无法进行拼接，在引物选择时应引起注意。

DGGE技术与高通量测序技术在环境微生物群落多样性研究中有什么区别？

DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中的优势种群，需要标准菌株，且受到凝胶电泳特性的局限，无法检测到稀有菌群的种类，因此其重复性和分辨率都不甚理想。而高通量测序技术能同时对样品中的优势种群及微量菌进行检测，获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化。

扩增子测序和宏基因组测序的区别？

扩增子主要分为16S、18S、ITS等测序，关注环境样本中的物种组成，该技术物美价廉，实用性高。宏基因组关注环境样本中的物种组成、功能组成及代谢通路等信息，该技术深入挖掘环境样本功能层面的信息。

是否需要生物学重复，多少个合适？

为了数据质量、结果产出及顺利投稿，必须注意生物学重复问题。考虑到个体差异，后期组间统计学分析以及偏离样本，自然环境至少3个生物学重复，推荐5个；若是人类的肠道、粪便等样品，由于个体特异性高，建议10个以上的重复。

若关注环境中的真核微生物多样性，18S测序和ITS测序哪个更好?

ITS测序主要是针对真菌多样性的研究，注释准确度高；18S测序针对的是真核微生物，注释到的范围广，但是就真菌来说精确度相对较低；可根据研究目的合理选择测序方案。

扩增子测序和宏基因组测序的对象主要是环境微生物，请问针对此类样本推荐的DNA提取方法是什么？

针对环境样本推荐老师采用常规的CTAB法或SDS法；其中人和动物组织样本使用SDS方法，其他样本采用CTAB法。另外，针对一些较难提取的样本或您希望提高样品DNA的提取效果，推荐使用Mobio公司专门的环境样本DNA提取试剂盒。

分类学注释中Unclassified、Unidentified及Others分别表示什么意思？f_Legionellaceae和f_Legionellaceae,g_s_有何区别？

Unidentified：分类学比对时在设定的置信阈值以下或没有分类信息的reads；Unclassified：在数据库中没有找到对应于该序列的分类信息；Others：注释到多个数据库的reads；此处应注意，物种相对丰度分布图中的Others则包含上述三种注释结果及相对丰度小于1%的物种。g_和s_是数据库中在属和种水平有对应的序列信息，但是没有注释信息，f_Legionellaceae是数据库中在属和种水平没有对应的序列信息。

样品OTUs Venn分析图中每个样品的OTU数为什么和各样品所含OTU数及序列数统计表格中的OTU数不对应？

不同的样品的序列数不同，为了排除因样本间测序数目不同而引入的误差，所以以序列数最低的样品为标准，对不同样品进行重抽样，使各样品的序列数在同一水平下进行样品间的比较分析。

物种相对丰度热图分析中为什么数据结果的表格中没有负值，而图中的图例有负数？

直接用相对丰度值进行热图的绘制，常常会由于聚类结果中出现相对丰度值分布不均匀，导致大部分丰度较低的物种呈现相同或相近的颜色，不利于样品及物种间的比较分析，因此我们在绘制之前对数值进行了标准化，即对每一个丰度排在前30的物种单独进行z-Score并取自然对数后绘制热图。

Alpha多样性的结果怎么看，各指数之间是否可以进行比较？

Alpha多样性即样品内部的生物多样性，跟其他样品无关，但不同的样品之间亦可以进行数值上的比较（在序列数目一致的前提下）。Alpha多样性根据OTU table和系统发育树进行计算，通常计算的参数包括 observed species指数（OTUs）、chao1指数、shannon指数、simpson指数以及PD whole tree，其中observed species指数和chao1指数反映样品中群落的丰富度，即简单指群落中物种的数量（OTU数目），而不考虑群落中每个物种的丰度情况，数值越大，说明样品中物种越丰富；shannon指数、simpson指数以及PD whole tree反映群落的多样性，受样品群落中物种丰富度和物种均匀度的影响，shannon、simpson指数以及PD whole tree的值越大，说明样品群落多样性越高。