“细菌作为地球上最古老的生物之一，至少在大约18亿年前就已在地球上广泛传播。它们无处不在且数量惊人。 从严寒极地到酷热赤道，从巍峨山顶到幽深海底，从动植物到森林土壤，都可以找到它们。每种细菌都适合生活在特定的环境环境中。但是，由于我们看不到它们并且对它们的了解相对较少，因此细菌的世界对我们来说是神秘的。客观全面认识细菌，是我们正确利用它们的第一步。”



HIFI技术的产生

从1995年第一个物种流感嗜血杆菌完成图到现在，细菌基因组完成图走过了将近30多个年头。在此期间，测序技术也在不断的发展，从原来高成本的sanger测序到后来的短读长的illumina测序，再到最近出现的第三代ONT测序技术，对于拼接细菌完成图的效果仍不尽如人意。因此寻找一种高通量、长读长、高准确率的测序技术是广大研究人员的目标，而HiFi测序技术以其长读长（长度可达25 kb）、高准确率（≥Q30，即超过99.9%的测序精度）、单分子分辨率、高灵敏度、无GC偏好性等优势，在微生物研究中表现出极大的应用优势。



什么是HIFI测序？

HiFi reads是基于Sequel II平台推出的CCS(Circular Consensus Sequencing）测序模式产生的兼具长读长和高准确度的测序序列。该测序模式下的酶读长远大于插入片段长度，测序时，聚合酶会绕着DNA模板进行环形比对测序，使得插入片段被多次测序，经过一致性校正，最终得到高准确度的HiFi reads，用于基因组组装。



HIFI测序的优势

1

单碱基分辨率高

PacBio测序基于边合成边测序的原理。实时记录荧光信号，转化为单碱基信息，获得具有单碱基分辨率的高精度序列。

PacBio测序：单碱基分辨率



而ONT则是基于电信号原理，一次产生的信号包含4-5个碱基, 需要对信号进行碱基解码，而在解码过程中容易受到噪音信号和随机数据的影响，从而出现delete和insert的错误，降低了ONT技术的单碱基分辨率。

Nanopore单信号包含4-5个碱基



2

序列准确度高

我们知道PacBio在测序过程中会发生随机错误，所谓随机错误，其产生错误的位置不会总发生在同一个地方，而CCS模式可通过自身纠错获得准确率高达99%的序列。而ONT技术的测序错误率高达10-12%，且其发生的则是系统错误，产生错误的位置总是在同样的区域，如果发生错误的区域恰好二代测序无法覆盖到，那么我们就难以利用二代数据进行校正，那么错误会一直残留到最终的序列结果中， 从而导致难以区分序列错误和真实突变。



3

测序错误无GC偏好

PacBio在测序错误上没有明显的偏好性，即使在高低GC区域，也能实现均匀覆盖。而ONT技术在测序错误上则存在明显的偏好性。在高GC含量区域、同聚物区域和串联重复区域错误率大大增加。导致ONT数据在这些地方检测到的结构变异可信度较低。

PacBio无明显错误偏好性

ONT的测序错误在高GC区域显著增加



4

组装周期短

用于组装的HiFi reads是经过纠错的一致性序列，组装时不需要再进行纠错，而ONT数据因其序列错误率较高，在进行细菌完成图的组装过程中，一般会选取二代数据对其进行纠错和校正，因此利用HIFI技术进行细菌完成图的组装周期明显短于ONT+Illumina的组装周期。



说了这么多，咱们总结一下HIFI技术与ONT技术的优缺点。HIFI技术兼具了长读长，高准确率的特点，而ONT技术虽然准确率欠缺，但是在读长方面会比HIFI技术略胜一筹，至于该用哪种方式进行测序，老师可以根据自己的需求进行选择！