作物产量的增加与农药的贡献密切相关，其中除草剂约占农药使用总量的47%。虽然除草剂的应用可以提高农业产量，但其残留物已成为一个严重的环境问题。烟嘧磺隆作为常用除草剂之一，本研究旨在探讨长期烟嘧磺隆残留对除草剂工厂生态系统的影响，同时采用高通量测序技术研究环境微生物群落结构及其之间相互作用。关注“太阳集团2018网站科服”微信公众号，后台回复220809，即可下载本文原文~

Effects of long-term exposure to the herbicide nicosulfuron on the bacterial community structure in a factory field

长期接触除草剂烟嘧磺隆对厂区细菌群落结构的影响

作者：Qingyun Ma, Hao Tan等

期刊：Environmental Pollution

时间：2022.05.19

影响因子：9.988

DOI：10.1016/j.envpol.2022.119477

一、文章摘要

背景：作物产量的增加与农药的贡献密切相关，其中除草剂约占农药使用总量的47%。磺酰脲类除草剂自20世纪80年代以来一直被使用，占了相当大的市场份额。虽然除草剂的应用可以提高农业产量，但其残留物已成为一个严重的环境问题。一些报告表明，土壤中除草剂残留会影响微生物的活性和多样性。烟嘧磺隆作为常用除草剂之一，了解烟嘧磺隆的生态效应在评估其对环境的潜在风险时是很重要的，其次，由于微生物在环境中残留农药的降解中起着至关重要的作用，其对被污染环境的修复也引起广泛关注。

目的：本研究旨在探讨长期烟嘧磺隆残留对除草剂工厂生态系统的影响，同时采用高通量测序技术研究环境微生物群落结构及其之间相互作用。

二、主要方法及内容

实验材料：15 个磺酰脲类药物样品，3个土壤样品（S1、S2和 S3 ，S3 不含烟嘧磺隆，可作为空白对照），1个污水样品（W）和1个活性污泥样品（M）（表1）。所有实验均采用3个重复的对照组进行。土壤中的烟嘧磺隆残留显著改变了微生物组成（表2）。

表1. 五个样本的环境因素

表2. 土壤样品中来自不同门的细菌群落

“*”表示不同样本之间存在显著性差异。较深的颜色代表较高的相对丰度。

DNA提取及PCR扩增

用引物515F和907R扩增了细菌V4-V5区域的16SrRNA基因，用引物Arch519F和Arch915R扩增了16SrRNA基因的古生菌V4-V5区；添加Barcodes 。纯化后的PCR扩增产物使用IlluminaMiSeq2500(300bp对端扩增序列)平台进行测序。

SynCom的构建及烟嘧磺隆降解效率促进效果的验证

根据样品类型和烟嘧磺隆残留物特征选择环境样品，从工厂环境样品中分离出81株潜在降解菌株。基于Illumina序列数据库进行分析，并对分离的细菌进行序列比对，选择3株共现网络分析得到的关键菌株（食醚红球菌，红平红球菌和指示窄食单胞菌）和其他降解菌株组成不同的合成群落(SynCom)。SMC1组含有2株红球菌及2株降解菌株；SMC2组含有食醚红球菌和指示窄食单胞菌及其他2株降解菌株；SMC3组含有红平红球菌和指示窄食单胞菌以及另外2株降解菌株。SMC4组不包含关键菌株，只有4株降解菌株。以无菌株的GSM培养基体系为对照，测定SynComs对烟嘧磺隆的降解促进作用。

数据分析

使用QIIME软件对序列进行合并和分割，将相似度≥97%的序列分配到同一操作分类单元(OTU)，之后采用网络分析方法探讨除草剂工厂生态环境中细菌的相互作用，再运用单因素方差分析（方差分析）测定了15个样本对微生物群落多样性和结构的影响，最后通过皮尔逊相关法来确定样本的Alpha多样性与环境因素之间的相关性。

三、主要结果

1.微生物分类群和系统类型的分布

我们根据16S rRNA基因扩增子测序的结果，分析了微生物群落的组成。每个样本采集3个重复进行分析。在15个样本中，获得了119,880个高质量序列和不同分类水平(标准差[SD])的样本和OTUs汇总。所有序列聚类为11,956个OTUs。每个样本的OTUs数量一般为247~2008个，平均为1330个(SD=562)。根据97%的序列相似性，最终得到的总OTU数为9604。OTUs主要属于拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、奇古菌门、绿弯菌门、厚壁菌门以及酸杆菌门。

2. 细菌群落的Alpha多样性分析

Alpha多样性分析报告了微生物群落的多样性和丰度。细菌Alpha多样性分析结果表明：S1>S2>M>S3>W，且细菌的Shannon指数和Chao1指数的变化趋势是一致的(图1)。与细菌不同的是，古生菌的Shannon指数与Chao1指数有不同的变化趋势（图2），污泥和污水中古生菌的微生物多样性高于S2和S3，但丰富度则相反。与细菌一样，古生菌的Alpha多样性随着土壤中烟嘧磺隆残留物浓度的增加而增加。

图1. 不同样品中细菌群落多样性(A)和丰富度(B)的差异；不同样品类型(C)和不同土壤(D)中OTUs数量维恩图

图2. 不同样品中古菌群落多样性(A)和丰富度(B)的差异；不同样品类型(C)和不同土壤(D)中OTUs数量维恩图

3. 长期接触烟嘧磺隆的细菌群落特征

选择在门水平上相对丰度最高的前10个物种，以生成相对丰度堆叠直方图（图3A）。环境中排名前30位的细菌属的热图如图(图3B)所示。结果表明，不同属水平和不同样本类型的物种存在显著差异。污水的微生物结构和组成与土壤和污泥有很大差异：土壤以拟杆菌门、变形菌门和奇古菌门为主；厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门是污泥中最具优势的三个细菌门；而污水中则以放线菌门和变形菌门为主。土壤中的烟嘧磺隆残留也显著改变了微生物组成。基于加权和未加权的UniFrac距离的主坐标分析以及永久试验显示：5个样品的细菌群落存在明显差异，且样品类型和烟嘧磺隆残留是除草剂工厂环境中微生物群落结构差异的主要原因（图4）。

图3. (A)细菌群落在门水平分类的前10种；(B)热图：显示环境中在属水平上相对丰度的前30种

图4. 基于未加权(A)和加权UniFrac距离(B)的不同样本细菌群落的主坐标分析(PCoA)

4. 与环境因素相关的细菌群落

环境因子参数见表1。对所有样品和土壤样品的微生物群落结构和环境参数进行RDA和线性回归分析。基于所有样品，RDA分析中，代表氧含量的箭头最长，表明氧含量是微生物群落结构的主要影响因素(图5Ad)；线性回归分析显示，pH和氧浓度与微生物群落丰富度呈显著正相关(图5Aa-Ac)。基于土壤样品，其RDA分析表明烟嘧磺隆残留的贡献率最高(图5Bd)，线性回归分析表明细菌群落丰富度与烟嘧磺隆呈显著正相关，与土壤氧含量和pH无显著相关(图5Ba-Bc)。

图5. 线性拟合分析；RDA分析。r2表示相关系数的大小，p值由T检验生成

5. 网络分析

基于斯皮尔曼相关性的网络分析揭示了长期接触烟嘧磺隆环境中的微生物之间的相互作用。该网络中的节点分布在10个细菌门中。其中拟杆菌门、变形菌门、酸杆菌门、硫古菌门和氯霉门分布广泛，占所有节点的70%（图6A）。当网络中的节点模块化时，节点分为四个主要模块（图6B）。模块1的节点多为拟杆菌门和酸杆菌门，模块2的节点多为酸杆菌门和变形杆菌门，模块3的节点多为变形杆菌门和拟杆菌门，模块4的节点多为酸杆菌门。关键类群属为红球菌、窄食单胞菌、硝基螺旋菌、土单胞菌和亚硝基单胞菌科MND1。此外，在大多数样本中，差异丰富的前10个属中均检测到红球菌，是差异丰富属的重要特征之一，尤其是污水群。

图6. 基于相关性分析的共生细菌属网络。
(A)由门着色的共发生网络;(B)由模块化类表示的共现网络。

6. 使用四种不同的降解菌株来提高SynCom的降解效率

在富集和分离后，从不同的培养基中分离得到81株菌株，验证这些菌株对烟嘧磺隆的降解效率，最终得到了10株降解效率高的菌株。烟嘧磺隆在SMC1、SMC2和SMC3组的降解效率显著高于对照组和SMC4组，同时在降解系统中检测到不同程度的pH下降(图7)。.SMC1、SMC2和SMC3均含有共现网络中的关键种红球菌，其降解效率显著高于SMC4。这表明其他烟嘧磺隆降解菌株组合对SMC4组的降解效率没有显著提高，而红球菌的加入可以稳定或提高SynCom降解效率。此外，具有高降解效率的SynCom是由高降解效率的菌株或作为共现网络中的关键物种的菌株组成的，因此我们猜测，这些通过自上而下的方法选择的潜在降解菌株可以用于提高SynCom的降解效率。

图7. (A):GSM培养基中pH值变化；(B):4个SynComs的烟嘧磺隆降解效率的变化

四、总结讨论

结论：细菌群落结构取决于微生物组处理环境因素的能力，确定在微生物生态学中长期暴露于烟嘧磺隆污染中的微生物组成和影响具有重要意义。我们的研究结果表明，长期接触烟嘧磺隆的环境中丰富了许多与烟嘧磺隆降解相关的微生物。随着烟嘧磺隆残留物浓度的增加，微生物多样性的增加，这可能是由于一些土壤微生物通过持续的接触烟嘧磺隆残留物适应了长期的压力和富集选择。当生存环境条件改变，如外来生物化合物被纳入系统时，各种微生物组成可能会发生适应性变化。根据微生物群落分析，土壤、污泥和污水样品中的细菌群落存在显著差异，即土壤、污泥和污水塑造了不同的微生物群落和潜在的微生物功能，此外，pH值和氧含量是影响微生物群落的主要因素。由此可知，环境因素将直接或间接地塑造微生物群落。

亮点：共现模式有助于理解复杂微生物群落的结构和组装，并预测潜在的生态功能。迄今为止，还没有关于长期接触烟嘧磺隆下微生物相关网络构建模型的报道。了解烟嘧磺隆除草剂在环境中的细菌共现模式，对于区分具有已知和未知功能的细菌之间的潜在相互作用尤为重要。介质中心性突出了它确定环境中关键物种的能力。比如红球菌、窄食单胞菌、硝基螺旋菌、土单胞菌和亚硝基单胞菌科MND1的鉴定在网络中的介质中心性得分最高，即这些细菌可能在维持生态群落的结构和功能扩张方面发挥重要作用。与随机网络比较，长期暴露于烟嘧磺隆下，细菌群落的模块性和连通性更好，说明了烟嘧磺隆在这些群落结构中的形成作用。其高度模块化的网络结构呈现出多种交互式的物种集群特征，不同的网络模块代表了物种与不同生态位共享范围之间的相互作用程度。此外，进一步优化条件可能使SynCom具有更高的降解效率，并可用于快速修复受污染的环境。在后续构建降解合成群落时，可以考虑到菌株的降解能力以及菌株在环境中的生态位置。将基于高通量测序和培养组学技术的自顶而下方法与SynCom方法相结合，或将成为农业土壤修复和绿色农业的基石。