本研究通过宏基因组学和培养相结合的方法研究参与TCEP完全降解的潜在细菌联合体及其协同作用。通过一系列实验，证实TCEP 的逐步水解可能由不同的细菌行会催化，强调了TCEP降解过程中协同相互作用的重要性。关注太阳集团2018网站科服微信公众号，后台回复0713，即可下载本文原文~
根瘤菌是两个细菌联合体降解三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP）的关键成员
Rhizobiales as the Key Member in the Synergistic Tris（2-chloroethyl）Phosphate （TCEP） Degradation by Two Bacterial Consortia
作者：Yi Liang, XiangyuZhou, YidingWu, YangWu, ShutaoGao, XiangyingZeng, ZhiqiangYu
期刊：Water Research
时间：2022.4.14
影响因子：11.236
DOI：10.1016/j.watres.2022.118464
文章摘要
背景：有机磷酸酯（OPEs）作为阻燃剂和增塑剂大量应用于电子、纺织和家具等各种行业，并很容易通过磨损、挥发和浸出释放到环境中。其中三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP）因其普遍存在、潜在毒性以及在环境中的存在持久性而受到越来越多的关注。
微生物降解是一种经济且污染小的清除方法。微生物降解TCEP的相关研究主要集中在分离株上。目前在TCEP降解物的多样性以及降解过程中细菌群落间的生态协作仍缺乏充分研究。
目的：
1.研究降解菌群对三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP）及其主要转化产物二（2-氯乙基）磷酸酯（BCEP）和单氯乙基磷酸酯（MCEP）的降解情况。
2.通过宏基因组学和培养相结合的方法研究参与TCEP完全降解的潜在细菌联合体及其协同作用。
实验设计
1.TCEP降解细菌的样本设置
细菌 A1、A2 和 A3 用河流沉积物样品（TCEP浓度为4.83mg/L）进行接种，并以醋酸钠作为唯一碳源，喂养大约一年的时间。A1、A2和A3随后用于两组细菌TCEP降解实验，分别为适应性实验和富集实验。
2.适应性实验
将细菌A1、A2和A3的碳源从醋酸钠切换为浓度为50 mg/L的TCEP。每个样本设置三个重复用于适应实验（A1a-c、A2a-c、A3a-c）。随着时间的推移，采集样本进行化学分析和16S rRNA基因扩增子测序，直到TCEP及其主要产物（BCEP和MCEP）降解。
3.富集实验
A1、A2和A3以50 mg/L TCEP作为唯一的碳源，开发出具有TCEP降解能力的培养物AT1和AT3，在加入8次TCEP后，AT1和AT3的培养物达到足够的生物量，被收集用于16S rRNA基因扩增子测序、宏基因组测序和TCEP降解测试，收集了加入TCEP前的A1、A2和A3的培养物作为比较。
4.纯培养分离
来自AT1和AT3的等分试样被连续稀释并铺在含有TCEP或BCEP（10 mg/L）的MSM琼脂板上。分离出的菌株进行了3次菌种筛选以确保纯度，然后测试降解能力。随时间推移采样并提取分离物的DNA，进行16S rRNA基因扩增。扩增后的16S rRNA基因（约1350 bp）经测序，并用RDP数据库分类和BLAST进行鉴定。通过系统发育分析，构建了由选定的降解TCEP和降解BCEP的分离物组成的联合体，并对其降解动力学进行分析。
主要结果
1. 适应性实验中从 A1（a-c）和A3（a、c）中观察到 TCEP 降解（图1），而A2（a-c）和A3b中均未检测到TCEP降解。
图1. 适应性实验的样品设置
图2. A1a（图a）和A3a（图b）中TCEP、BCEP和MCEP的降解动力学
A1（a-c）的降解模式：
TCEP开始于第9-11天，浓度降至检测限以下，A1a、A1b和A1c的反应速率分别为14.9、10.1和12.4 mg/L-d。
BCEP在第13-16天累积至浓度峰值37.5-43.8 mg/L，并在第19-21天降至检测限以下。
MCEP在第11-13天出现，在第16-19天达到峰值浓度，并分别在第19、21和20天降至检测限以下。
A3（a、c）的降解模式：
TCEP浓度经历了10天的观察滞后期，然后降至检测限以下，反应速率为10.5和10.9 mg/L-d。
BCEP在第10天出现，在第19天分别增加到44.8 mg/L和45.1 mg/L，并在第23天之前保持稳定4天，首次检测到MCEP时。
MCEP在第30天达到峰值浓度，在第33天降至检测限以下。A3b没有表现出TCEP降解，可能是因为它没有包含足够的TCEP降解菌株。
适应实验中通过16S rRNA基因扩增子测序跟踪了TCEP降解过程中的细菌群落变化。得出主要的菌种有：固氮螺菌目Azospirillales（69.2-91.9%）、红环菌科Rhodocyclaceae（3.2-15.4%）、假单胞菌目Pseudomonadales（0.19-9.8%）。其中根瘤菌Rhizobium是值得关注的菌种，因为它在所有瓶子的TCEP降解过程中都增加了，A1（a-c）中丰度从0.43%增加至2.15%，A3a和A3c中丰度从0.34%增加至1.01%。
图3. A1a、A3a的TCEP降解过程中根瘤菌属的增加（图c）
2.富集实验中AT1和AT3的TCEP降解动力学
前文提及到AT1和AT3是具有TCEP降解能力的培养物。通过富集实验得出，在AT1中，BCEP在5小时内积累到8.69 mg/L，然后在15小时内下降到0.49 mg/L。
在AT3中，BCEP在3小时达到峰值26.91 mg/L，然后在25小时下降到0.44 mg/L。MCEP在AT1和AT3中都在5小时达到峰值，AT3的MCEP峰值浓度比AT1高3.16倍。MCEP在AT1的15小时和AT3的25小时内下降到低水平。在没有添加培养物的对照组中没有观察到TCEP降解或BCEP/MCEP检测。
结果表明AT3比AT1表现出更高的BCEP积累和更慢的BCEP降解。
图4. TCEP、BCEP和MCEP在AT1（a）、AT3（b）中的降解动力学
富集实验中TCEP富集前后细菌群落结构的比较得出：根瘤菌Rhizobium是促进两个菌群中有效 TCEP 降解的关键细菌（图4）。在适应实验和富集实验中，根瘤菌是唯一在菌群中持续增加的两个级水平的细菌之一，并表现出TCEP降解能力。根瘤菌群丰度的增加和样本整体TCEP降解能力的升高，说明了根瘤菌群在TCEP降解中的重要性。
图5. A1、A2、A3、AT1和AT3的总体细菌群落组成
3.宏基因组测序显示TCEP富集后细菌群落的代谢潜力的变化
AT1和AT3在糠醛降解、苯乙烯降解、硝基甲苯降解和二甲苯降解等多种与外源生物降解代谢相关的途径中富集。宏基因组数据进一步分析了磷酸酯酶相关基因，包括磷酸酯酶（PE）、金属磷酸酯酶（MPE）、磷酸二酯酶（PDE）、碱性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）相关基因。
图6. 来自扩增子文库和磷酸酯酶基因（PE、MPE、PDE、ALP、ACP）的16S rRNA基因序列的相对丰度热图
最终研究通过菌株分离、降解动力学分析，得出具有降解TCEP和BCEP功能的分离物AT3-10和AT1-8b都归类为根瘤菌，并与黄杆菌菌株NBRC 14759具有99.78-100%的16S rRNA基因序列相似性。AT3-10和AT1-8b的共培养物对TCEP和BCEP有着高效降解的作用。
图7. TCEP降解菌株的系统发育树（图a）、AT3-10的TCEP降解动力学和BCEP积累（b）、AT1-8b的BCEP和MCEP降解动力学（图c）、AT3-10和AT1-8b共培养物的TCEP降解（图d）
总结
在这项研究中，分离出两个高效的TCEP降解联合体（AT1和AT3），联合体AT1、AT3能够在20-25小时内完全水解TCEP。同时，该研究确认根瘤菌为AT1和AT3中的关键降解剂。因为当碳源从乙酸盐变为TCEP时，根瘤菌相关的磷酸酯酶基因富集了一到两个数量级。此外，根瘤菌属丰度的增加与TCEP降解有关。黄杆菌的分离菌株证实了根瘤菌的有效TCEP和BCEP降解。AT3中TCEP降解较快可能与根瘤菌属、噬细胞菌属、鞘氨醇杆菌属和伯克霍尔德菌属相关的磷酸酯酶基因具有较高丰度有着关联，而较高丰度根瘤菌属相关的磷酸二酯酶（PDE）基因可能有助于AT1中更快的BCEP降解。TCEP 的逐步水解可能由不同的细菌行会催化，这通过TCEP和BCEP降解分离物的共培养得到证实，并强调了TCEP降解过程中协同相互作用的重要性。
